suncitygroupapp太阳新城-App Store下载

2×ligation solution MasterMix

2×DNA连接缓冲液

●  产品组成：

注；按照10μl连接体系计算，每次使用5μl，可以使用30次。

● 保存：-20℃

● 产品简介：

2×ligation solution MasterMix是含有T4 DNA Ligase，ligation buffer的2×MasterMix，实验时，只需加入片段和载体即可进行连接反应。

适用于DNA片段和载体DNA的连接以及DNA片段和Linker或Adaptor DNA的连接。

● 注意事项

1．2×ligation solution MasterMix由于含有T4 DNA ligase，使用前冰浴中彻底融化，混匀后使用。

2．为了提高转化效率，转化时建议所加入连接产物的量不要超过感受态细胞体积的10%。

● 使用方法：

一 DNA片段和载体DNA的连接

1）粘性末端的连接

1．反应体系:

*：载体与插入片段的摩尔数比需要优化：一般vector:insert在1:1~1:5之间均可得到较好的结果。用以下公式计算片段摩尔数：pmol数= DNA量(ng)/(660×片段bp数)×1000。例如：插入片段2000bp，线性载体为3000bp，如果载体使用量为50ng（0.025pmol），10μl连接体系中vector:insert的摩尔比是1:3，则需要2000bp pmol数为0.075pmol，插入片段2000bp的使用量为100ng。

2．彻底轻柔混匀后，瞬间离心，将管壁上的溶液收集到管底。

3．反应条件：16℃孵育30分钟。

4．可取5 μl连接产物热击转化50 μl感受态细胞或取1-2 μl连接产物电击转化50 μl感受态细胞。

注：1）若要提高电转实验效率，推荐65℃孵育10分钟或70℃孵育5分钟以灭活T4 DNA Ligase后，用DNA产物纯化试剂盒或氯仿抽提对连接后的DNA片段进行纯化后进行电击转化。

2）若要提高转化子数目，可将连接时间延长至1小时。

2）平末端的连接

1．反应体系:

*：平滑末端的载体与 DNA 片段进行连接时，应首先将载体进行去磷酸化处理，以防止其自身环化。

**：载体与插入片段的摩尔数比需要优化：一般vector:insert在1:1~1:5之间均可得到较好的结果。用以下公式计算片段摩尔数：pmol数= DNA量(ng)/(660×片段bp数)×1000。例如：插入片段2000bp，线性载体为3000bp，如果载体使用量为50ng（0.025pmol），10μl连接体系中vector:insert的摩尔比是1:3，则需要2000bp pmol数为0.075pmol，插入片段2000bp的使用量为100ng。

2．彻底轻柔混匀后，瞬间离心，将管壁上的溶液收集到管底。

3．反应条件：16℃孵育30分钟。

4．可取5 μl连接产物热击转化50 μl感受态细胞或取1-2 μl连接产物电击转化50 μl感受态细胞。

注：1）若要提高电转实验效率，推荐65℃孵育10分钟或70℃孵育5分钟以灭活T4 DNA Ligase后，用DNA产物纯化试剂盒或氯仿抽提对连接后的DNA片段进行纯化后才能进行电击转化。

2）若要提高转化子数目，可将连接时间延长至1小时。

二 线性DNA的自身环化

1．反应体系:

2．彻底轻柔混匀后，瞬间离心，将管壁上的溶液收集到管底。

3．反应条件：16℃孵育30分钟。

4．可取5 μl连接产物热击转化50 μl感受态细胞或取1-2 μl连接产物电击转化50 μl感受态细胞。

注：1）若要提高电转实验效率，推荐65℃孵育10分钟或70℃孵育5分钟灭活T4 DNA Ligase后，用DNA产物纯化试剂盒或氯仿抽提对连接后的DNA片段进行纯化后才能进行电击转化。

三 接头连接

1．反应体系:

2．彻底轻柔混匀后，瞬间离心，将管壁上的溶液收集到管底。

3．反应条件：16℃孵育30分钟。

4．65℃孵育10分钟或70℃孵育5分钟灭活T4 DNA Ligase。连接产物可以直接进行限制性内切酶酶切反应。