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   Blue/Clear 非变性凝胶电泳试剂盒

   Blue/Clear Native PAGE Electrophoresis Kit 

● 货品内容：

● 产品简介：

Blue/Clear Native PAGE（BN/CN-PAGE）是一种从生物样品（质膜，胞浆等）中分离分子量10 kD-10 M kD 范围的蛋白质复合物的电泳技术。其原理是用温和去污剂(如 DDM，digitonin)将蛋白复合体从细胞膜中以近似天然的状态分离出来，Blue Native PAGE （BN-PAGE）是用考马斯亮蓝 G-250 代替 SDS与蛋白结合而使其带负电荷，根据蛋白分子量不同在 PAGE胶中得到分离；Clear Native PAGE（CN-PAGE）是电泳缓冲液中不加入任何染料，电泳中始终保持蛋白的天然电荷和活性状态，然而，其蛋白的分辨率要低于Blue Native PAGE。另外，BN-PAGE由于考马斯亮蓝G-250存在，使蛋白都覆盖上负电荷，可以分离碱性蛋白（pI＞7）；而CN-PAGE只适合于酸性蛋白（pI＜7）的分离。

本产品包括BN/CN-PAGE制胶的所有成分，方便使用。可以用于分离分子量在 10 kD-10M kD 的蛋白复合体，样品可以来于胞浆、细胞总裂解液、细胞膜、线粒体膜和叶绿体膜等。电泳后可直接用于考染、银染、Western 杂交、SDS-PAGE电泳、蛋白纯化、蛋白活性检测等分析实验，也可直接用于电洗脱制备蛋白。

● 运输和贮存：

本产品常温运输；组份按照标签温度贮存；有效期一年。

● 使用说明：

1. 样品制备：

   该试剂盒不含样品制备的相关试剂，样品具体制备方法参考Blue Native PAGE. Wittig I, Braun H, Schagger H. Nature Protocols. Vol 1,No 1,418,2006.

2. 电泳：

2.1 拆开预制胶包装，将预制胶安装在合适的电泳槽中。

注：试剂盒配套预制胶兼容伯乐Mini III或Mini-PROTEAN Tetra Cell，天能VE-180，六一24K系列电泳槽。

不兼容Thermol，六一其他系列，君意东方JYCZ2/4，百晶等电泳槽。

2.2 准备电泳缓冲液：

将10×BN/CN PAGE电泳缓冲液（干粉）溶于500 ml灭菌水中，彻底溶解，测定pH应为7.0左右，不要调节pH。用前稀释10倍即配成1×BN/CN PAGE电泳缓冲液。

2.2.1 CN-PAGE电泳：

阳极缓冲液和阴极缓冲液均直接使用1×BN/CN PAGE电泳缓冲液进行电泳。

2.2.2 BN-PAGE电泳：

阳极缓冲液使用1×BN/CN PAGE电泳缓冲液，阴极缓冲液按照下表配制：

2.3准备样品：

2.3.1 CN-PAGE电泳：

2.3.2 BN-PAGE电泳：

注：以下以植物类囊体膜蛋白电泳为例。

* 含去垢剂样品中染料加入按照以下原则：

样品中G250终浓度为去垢剂终浓度的1/4。

例如样品中DDM终浓度为1%，则需要G-250终浓度为0.25%。10 μl蛋白样品中需要加5% G-250染料0.5 μl。

2.4电泳过程；

2.4.1 CN-PAGE电泳：

电泳内外槽均使用1×BN/CN PAGE电泳缓冲液。在电泳槽的内槽内加入1×BN/CN PAGE电泳缓冲液(让电泳缓冲液漫过加样孔)，轻轻拨出预制胶梳子，用1ml吸头冲洗加样孔3次，随后在电泳槽外槽加入适量的1×BN/CN PAGE电泳缓冲液。

2.4.2 BN-PAGE电泳：

BN-PAGE电泳外槽使用1×BN/CN电泳缓冲液；内槽开始电泳使用的是1×蓝色阴极缓冲液，冰浴电泳，等待电泳指示前沿到达凝胶1/3处时，将电泳缓冲液更换为1×BN/CN电泳缓冲液，继续后续电泳，因为过多染料会影响蛋白在凝胶中的迁移以及蛋白后续的转膜实验。

BN-PAGE电泳条件（一板胶）

3. 转膜：

BN-PAGE转膜必须用PVDF膜，不能用NC膜，因为NC膜与G-250结合非常紧密。

转膜缓冲液使用1×BN/CN PAGE电泳缓冲液即可。

4. 染色：

4.1 将电泳后的PAGE胶取下放入塑料容器中，加入适量FastBlue蛋白染色液或常规考马斯亮蓝染色液（以刚刚覆盖过胶面为适），条带1-2分钟即可见。

4.2 摇床常温摇动10-15分钟至条带清晰可见。

4.3 加入适量蒸馏水脱色，期间更换1-2次蒸馏水，摇床常温摇动10-15分钟至背景干净。

4.4 观察保存结果。

4.5 实验示例：