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RealPure多糖多酚植物RNA提取试剂盒

RealPure多糖多酚植物RNA提取试剂盒

产品编号:RTR2304

产品规格:50次

数量
价格 ¥800


RealPure Plant RNA Extraction Kit

for containing high polysaccharide and polyphenol components

RealPure多糖多酚植物RNA提取试剂盒

货号

名称

规格

RTR2304

RealPure多糖多酚植物RNA提取试剂盒

50

试剂盒内容及保存:

试剂盒组成

RTR2304-01 50次)

贮存方式

裂解液RL

30 ml

常温

缓冲液PRS

3 ml

常温

裂解液RL plus

30 ml

常温

去蛋白液RD

30 ml

常温

漂洗液RW(浓缩液)

25 ml

首次使用按照标签加入无水乙醇

常温

RNase-free

5 ml

4

DNA清除柱CSRNase-free

50

常温

RNA吸附柱CRRNase-free

50

常温

收集管

100

常温

2 ml离心管(RNase-free

50

常温

1.5 ml离心管(RNase-free

150

常温

说明书

1

 

储存条件和效期:

RNase-free水4℃保存;其他试剂在常温(25℃左右)干燥条件下,可保存1年。试剂盒常温运输。

产品简介:

本试剂盒可从植物叶片、茎、幼苗、果肉中快速提取总RNA,可同时处理大量不同样品。试剂盒配套缓冲液PRS(Phenolic Remove Solution)可以去除植物中的多糖多酚对RNA提取的影响。20-30分钟内即可完成反应,提取的总RNA纯度高,没有DNA和蛋白的污染,可用于Northern blot、Dot blot、polyA 筛选、体外翻译、RNase 保护分析和分子克隆等实验。

该试剂盒不能有效提取植物种子、块茎、鳞茎的RNA,提取这些材料的RNA请选择RealPure植物种子RNA提取试剂盒(Cat:RTR2308)。

准备工作:

1操作前在裂解液RL中加入β-巯基乙醇至终浓度1%,如500 μl RL中加入5 μl β-巯基乙醇。此裂解液最好现用现配。配好的 RL4 ℃可放置3天。

2 按照标签所示在漂洗液RW中加入无水乙醇(自备),混匀后盖紧瓶盖后室温贮存备用。

3 所有离心步骤均在常温下进行。

操作步骤:

1. 样品处理:

1.1 1.5 ml离心管中加入500 μl裂解液RL(使用前请先检查是否已加入β-巯基乙醇),50 μl缓冲液PRS混匀备用。

注:多糖多酚植物(如银杏,毛白杨等)加入RL后,要加入缓冲液PRS,普通植物(如拟南芥,小麦,水稻,烟草)可以不加缓冲液PRS。如果不能判断植物是否为多糖多酚植物,请加入缓冲液PRS。

注:快速判断是否为多糖多酚植物:

取20mg左右的植物材料,放入1.5 ml离心管中,加入0.5 ml 0.2 M NaOH溶液,95℃ 10分钟,观察裂解物颜色。颜色为绿色或淡黄色为普通植物;颜色为棕黄色或棕红色为多糖多酚植物。

1.2将植物材料加入到液氮预冷的研钵中,用研杵研磨,其间不断加入液氮,直至研磨成粉末状。取50 mg粉末迅速加入到离心管中,涡旋剧烈震荡混匀,常温放置5分钟。

注:一定不要加入超过50 mg的粉末,否则样品超过裂解液RL的裂解能力会导致RNA提取失败。

背景知识:样品处理量绝对不要超过RNA吸附柱处理能力,否则造成RNA残留或者产量降低。不同植物组织RNA相差极大,例如某些植物种子如绿豆RNA含量丰富,超过50 mg就会超过柱子处理能力。所以开始摸索实验条件时,如果不清楚样品RNA含量时宁可使用较少的样品处理量,如植物叶片或植物种子裂解溶液中都不要超过50 mg,随后根据实验结果增加或者减少处理量。

2. 离心取上清:

13,000 rpm离心5 min,小心吸取收集管中的上清至1.5 ml RNase-free的离心管中,吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀。一般可获得400 μl上清。

3. 去除基因组污染:

上清中加入0.5倍体积的无水乙醇(如400 μl上清中加入200 μl无水乙醇),混匀(此时可能会出现沉淀),得到的溶液和沉淀一起转入DNA清除柱CS(清除柱放入收集管中)中,13,000 rpm离心2分钟,弃掉收集管中的废液。

注:确保全部溶液都收集到收集管中,如果膜上有残留液体,延长离心时间至5分钟,保证膜上无残留液体。

4. 洗脱RNA

  将DNA清除柱放入一干净的2 ml离心管中,在清除柱中加入500 μl 裂解液RL plus,13,000 rpm离心1分钟,收集滤液(注意:RNA在滤液中,不要丢弃),滤液中加入250 μl无水乙醇,此时可能会出现沉淀,立即混匀,不要离心。

5. RNA挂柱:

  将全部溶液加入到RNA吸附柱CR中(吸附柱放入收集管中),13,000 rpm离心2分钟。

注:确保溶液全部过滤到收集管中,膜上无残留,如有必要,可以延长离心时间至5分钟。

6. 去除RNA中的蛋白污染:

向RNA吸附柱CR中(吸附柱放入收集管中)加入500 μl 去蛋白液RD,13,000 rpm离心1分钟,弃废液。

7. 去除RNA中的其他杂质:

向RNA吸附柱CR中加入700 μl漂洗液RW(使用前请先检查是否已加入乙醇), 13,000 rpm离心1分钟,弃废液。

8. 进一步去除RNA中的其他杂质:

向吸附柱CR中加入500 μl漂洗液RW (使用前请先检查是否已加入乙醇),13,000 rpm离心1

分钟,弃废液,将吸附柱CR放回收集管中,确保盖好吸附柱管盖。

9.  关键步骤:彻底去除吸附柱上的残余乙醇:

13,000 rpm将吸附柱CR空甩离心2 分钟,去除吸附柱上的残余液体。

注:此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除,如果有漂洗液残留,可能会影响后续的RT等实验操作。

10. 洗脱得到RNA

将RNA吸附柱CR转入一个新的1.5 ml RNase-free离心管中,向吸附柱O型垫圈中央悬空加入50-100 μl RNase-free水(事先65℃预热可提高洗脱效率),盖好吸附柱管盖,常温放置2分钟,13,000 rpm离心2 分钟。

注:确保水要加到膜的中央,不要贴壁加入;洗脱缓冲液体积不应少于50 μl,体积过小影响回收效率。

11. RNA贮存:

RNA样品-80℃中保存。

RNA产量和质量的评估:

1. RNA产量:

用分光光度计测定OD260的吸光值来计算RNA产量。将RNA按照一定的比例稀释于TE溶液(10mMTris pH8.0,1mMEDTA)中,根据以下公式计算:

A260×稀释倍数×40=μg RNA/ml

注:测定OD值时,尽量不要用RNase-free水稀释RNA,因为RNase-free水pH较低,测定的OD值偏低。

2. RNA质量:

凝胶电泳检测:凝胶电泳中,完整的RNA应该有两条主带:28S和18S,并且28S亮度应该与18S相当或是其亮度的2倍。可以使用普通的1×TAE琼脂糖凝胶电泳,凝胶浓度1-1.5 %,可以使用高电压,短时间电泳,如7V/cm电泳,20分钟。建议使用D2000 DNA ladder(Cat:RTM415)作为Marker。植物28S rRNA迁移率与1500bp类似,18S rRNA迁移率与1000bp类似。

吸光值检测:可以用A230,A260和A280的数值表示RNA的纯度。纯净的RNA的 A260/A280比值应该为2,我们得到的RNA样品比值应在1.8-2.2之间,如果比值低于1.8,表明RNA样品中蛋白污染比较严重。A260/A230比值应该在2-2.2之间。如果此比值低于2,表明RNA样品中有胍盐,多糖的污染。



问题指南:

1. 离心柱发生堵塞       

离心柱发生堵塞之后会造成 RNA 得率降低甚至不能纯化得到 RNA。

常见原因分析如下:

1.1:样本破碎不彻底。

样本破碎不彻底会使吸附柱发生堵塞,同时会影响 RNA 得率及质量。我们建议在进行样本破碎的时候,在足量的液氮中快速研磨操作,尽量破碎样本细胞壁、细胞膜等组织。

1.2 样本初始量过多。

样本使用量过多会导致裂解液RL或裂解液RSL裂解细胞时不完全,导致离心柱堵塞。RealPure多糖多酚植物RNA提取试剂盒和RealPure植物种子RNA提取试剂盒处理样本的初始最大量为50 mg。

1.3 离心机的温度过低。

整个 RNA 分离纯化除了液氮破碎样本组织外,所有的步骤均在常温(20-25)进行。有些低温离心机的温度低于 20,可能会造成离心柱的堵塞。如果发生这种现象,请将离心机温度设置到 20-25

2. 提取不到RNA或者RNA产量低

通常会有多种因素影响回收效率,比如:样本 RNA 含量、操作方法、洗脱体积等。

常见原因分析:

2.1  样本保存不当或样本保存时间过久导致RNA 已经降解。

建议:新采集的样本应立即放入液氮中速冻,长期保存于-70并避免样本的反复冻融;或者将样本立即浸泡在 RNA 稳定剂RNAwait溶液中。

2.2  样本破碎裂解不充分导致纯化柱堵塞。

建议:在组织研磨时,请保证组织充分研磨,并在研磨完成后迅速转移至预先准备好的裂解液RL或裂解液RSL(确认已添加正确比例的 β-ME)中。

2.3  洗脱液添加不正确。

建议:确认 RNase-Free 水滴加到了纯化柱膜O型垫圈中央位置。

2.4  漂洗液RW中没有添加正确体积的无水乙醇。

建议:请按照说明书,在试剂盒使用前,漂洗液RW中添加正确体积的无水乙醇并混匀。

2.5  组织样本用量不合适。

建议:每 500 μl 裂解液RL或裂解液 RSL使用最大组织量50 mg,组织使用过多会导致 RNA 提取量降低并且得到的 RNA 纯度也会降低。我们强烈建议每单次 RNA提取操作,样本初始用量一定不要超过最大建议量。

2.6  洗脱体积不合适或洗脱不彻底。

建议:纯化柱的洗脱液体积为 50-100 μl;若洗脱效果并不理想,建议在加入65预热的RNase-Free 水后,延长常温放置的时间,例如放置 5-10 min。

2.7  纯化柱在第二次RW洗涤之后有乙醇残留。

建议:漂洗液RW洗涤后,吸附柱空甩离心2 min是关键步骤,以充分除去吸附柱上残留的乙醇。

2.8  试剂盒使用不正确。

建议:对于多酚多糖的植物样本,务必使用缓冲液PRS,这是我们专门针对多酚多糖植物样本而研制的多糖多酚去除剂,如不添加,将导致RNA不能挂柱或提取到纯度不高的RNA。

3. 纯化获得的RNA有降解

纯化得到的 RNA 的质量和样本的保存、RNase 污染、操作等因素有关。 常见原因分析:

3.1  组织样本采集后没有及时保存。

建议:组织样本在收集后若不及时使用,请立即低温保存于液氮中或经液氮速冻后立即转移至-70长期保存,或者将样本立即浸泡在 RNA 稳定剂 RNAwait溶液中。提取 RNA 请尽量使用新近采取的组织样本。

3.2  组织样本反复冻融。

建议:组织样本保存时,最好剪成小段保存,使用时取出其中一部分即可,避免样本的反复冻融导致 RNA 的降解。

3.3  操作间有 RNase 引入或没有佩戴一次性手套、口罩等。

建议:RNA 提取实验最好在单独的 RNA 操作间进行,并在实验前清理好实验桌,实验时佩戴一次性手套、口罩,最大程度上避免 RNase 引入导致的RNA 降解。

3.4  试剂在使用过程中被 RNase 污染。

建议:更换新的植物总RNA 提取系列试剂盒进行相关实验。

3.5  RNA 操作时所用的离心管、枪头等有 RNase 污染。

建议:确认 RNA 提取时所用到的离心管、枪头、移液器等都是 RNase-Free。

4. RNA中含有DNA污染

4.1 提取的起始材料超过50 mg

建议:步骤1-样品处理时用天平称取粉末重量,不要超过50 mg,否则样品的核酸量会超过DNA清除柱CS的处理极限,导致洗脱下的RNA有基因组DNA的污染。

4.2  省略了步骤3-去除基因组污染步骤。

建议:步骤3-去除基因组污染步骤必不可少,不能省略。DNA清除柱CS能极大限度的去除上清液中的基因组 DNA,使用裂解液RL plus洗脱下的RNA基本无基因组DNA的污染。

4.3  跳过了使用去蛋白液RD的漂洗步骤(见操作步骤第6步)。

建议:这一步骤对于除去残留的 DNA 以及杂质蛋白十分重要,一定不能省略,否则将会导致纯化得到的 RNA 中含有DNA 污染和蛋白污染。

5. 纯化获得的RNA影响下游实验

经吸附柱纯化的 RNA,如果盐离子、蛋白质含量过多会影响下游实验,比如:逆转录、Northern Blot 等。

1.  洗脱后的 RNA 有盐离子残留。

建议:确认漂洗液RW中添加了正确体积的乙醇,并按操作说明的离心转速进行2次RW洗涤吸附柱 (见操作步骤第7,8步)。

2.  洗脱后的 RNA 有乙醇残留。

建议:确认 RW第二次洗涤后,按操作说明的对吸附柱进行空管离心操作(见操作步骤第9 步),如果还有乙醇残留,可以将空管离心后吸附柱开盖常温放置 5 min,以最大程度上去除乙醇残留。

 

 


实验示例:




 
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