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PAGE胶蛋白微量回收试剂盒

PAGE胶蛋白微量回收试剂盒

产品编号:RTD8108

产品规格:20次

数量
价格 ¥600


PAGE胶蛋白微量回收试剂盒(货号:RTD8108       

试剂盒组成:

组份货号

试剂盒组成

规格

贮存

RTD8108-01

溶液A-洗脱液

10 ml

4-8

RTD8108-02

溶液B-助沉液

5 ml

4-8

RTD8108-03

溶液C-沉淀液

10 ml

4-8

DT0140P-01

1 M DTT(粉末)

1 ml

4-8

配制溶液后-20℃贮存

CF-20

过滤柱

20/

RT

YMC07-5

塑料研磨杵

5/

RT

 

说明书

1

 

运输、储存条件和效期:

常温运输,标签温度保存,有效期为一年。

产品简介及使用说明:

蛋白电泳不仅可用于检测蛋白质的相对分子质量,而且也是分离纯化蛋白质的重要工具之一,随着蛋白质技术的微量化,有必要从凝胶中回收蛋白质以用于制备抗体、免疫印迹、氨基酸组分分析或末端序列测定等,本产品就是专门为此用途开发的微量蛋白胶回收法,回收效率在50-80%。

按照每次使用400 μl 溶液A计算,试剂盒至少可以使用20 次。

使用方法:

1. 电泳:

按常规方法进行变性(SDS-PAGE)或非变性蛋白电泳(Native-PAGE)。

2. 切胶:

2.1 用手术刀片将铜染(货号:RTD6207)或锌染(货号:RTD6206)的胶块中含有目的条带的部分胶切下(尽可能地把多余的胶切除,否则会影响回收效率),放入1.5 ml的离心管中,用相应的消除液将胶中蛋白质条带脱色到胶体接近无色透明,超纯水漂洗凝胶两次,保留胶体进行步骤3。

2.2 由于考马斯亮蓝染色蛋白的特殊性,不建议考染后进行切胶操作。建议把样品分多孔上样,电泳后只切其中一个胶孔的胶条进行染色,然后将此胶条放回到在整体胶中原来的位置,通过显色胶条上的蛋白条带找到在未染色胶上对应区域,并切下胶体进行步骤3。

2.3 如不进行染色,可以使用预染Marker判断目的蛋白的位置进行切胶进行步骤3。但此方法缺点在于蛋白的位置难以精确判断。

3. 研磨处理:

3.1 称取1.5 ml离心管中胶块重量;用研磨杵充分将胶块压磨成尽可能细小的碎片。

3.2 即用型溶液A配制:

    根据溶液A的使用量配制即用型溶液A的体积。配制比例为:1 ml溶液A加入10 μl 1 M DTT溶液。

3.3根据胶块重量加入即用型溶液A,用研磨杵再次充分研磨,4℃摇床慢摇洗脱过夜(12-16小时)。

注:胶块重量和即用型溶液A体积大体按照1:4比例加入,如胶块100 mg加入400 μl即用型溶液A,溶液A使用量宁多勿少。洗脱时间与凝胶浓度,蛋白分子量大小有关,胶浓度越高,分子量越大,洗脱时间越长。

4. 过滤除胶:

用1 ml 的去尖吸头吸取混合物至过滤柱中(过滤柱放入收集管中),注意将碎胶一起吸入,溶液过多时可分次加入,12,000 rpm 离心2分钟,保留收集管中的滤出液(包含蛋白)。

5. 蛋白沉淀:

     5.1 将滤出液转移到1.5 ml离心管中,加入1/10体积的溶液B-助沉液,混匀,常温放置15 min。

     5.2 加入步骤5.1溶液1/4体积的溶液C-沉淀液,充分混匀后,冰浴15 min。

         注:加入溶液C后溶液变浑浊,需要彻底充分混匀。

5.3  4℃ 12,000 rpm离心10分钟,去除上清,保留蛋白沉淀。

   注:由于溶液B-助沉液的作用,此步骤得到管底很明显的蛋白沉淀物。

6. 蛋白漂洗:

6.1 蛋白沉淀中加入1 ml预冷的丙酮(自备,试剂盒不提供),彻底重悬沉淀,混匀,冰浴放置15 min。

6.2 4℃ 12,000 rpm离心10分钟,去除上清,保留沉淀。

    注:通过丙酮的漂洗,去除步骤5.3中蛋白沉淀中的非蛋白组份。

6.3 离心管快甩离心,用10 μl吸头将离心管中残余溶液彻底吸净,常温开口风干1-2分钟,待残留的液体挥发干净。

7. 蛋白贮存:

选用合适的缓冲液溶解沉淀的蛋白质,以方便进行后续的电泳和质谱测序等实验。


实验示例:

锌染后BSA切胶回收
40μl (20μg)BSA(0.5μg/μl)上样,锌染后
切胶回收,最后溶于40μl上样缓冲液中
上样5μl和10μl。回收效率高于90%。




 
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