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快速蛋白高灵敏度染色试剂盒

快速蛋白高灵敏度染色试剂盒

产品编号:RTD6401

产品规格:25次

数量
价格 ¥450

快速蛋白高灵敏度染色试剂盒

产品编号

规格

贮存

RTD6401

25

常温

贮存、运输及效期:

常温保存;常温运输;开封后一年有效。

产品简介

快速蛋白高灵敏度试剂盒是一种快速简单、可用于SDS-PAGE或非变性PAGE等蛋白分离后染色的试剂盒。本试剂盒也可以用于2D凝胶的染色,并且染色后兼容后续的质谱检测。本试剂盒只需约90分钟内可以完成凝胶的染色。对于BSA蛋白,检测灵敏度可以达到0.3 ng蛋白。

本试剂盒可足够用于25块常规的8×10 cm凝胶的染色。

说明书后附有实验记录表格,方便记录实验步骤。

产品组成:

产品编号

产品名称

规格

贮存

RTD6401-1

增敏液(100×)

26 ml

常温

RTD6401-2

染色溶液(100×)

26 ml

常温,避光

RTD6401-3

基本显色液(10×)

250 ml

4

RTD6401-4

显色加速液(2000×)

1.5 ml

常温,避光

RTD6401-5

终止液(20×)

125 ml

常温

● 注意事项:

1. 由于该方法染色非常灵敏,操作时请注意尽量使用高纯度的水,并确保所使用的器皿非常清洁,最好使用洁净的玻璃器皿。操作时必须戴手套,避免皮肤和凝胶直接接触。

2. 需自备乙醇、冰醋酸及MilliQ级纯水或双蒸水。

3. 下述使用说明中各种溶液的使用量适用于大小为8×10 cm厚度为0.75-1 mm的凝胶。对于更大的凝胶,各种溶液的使用量需按凝胶面积的比例放大;对于更厚的凝胶,作用时间需按照厚度的比例适当延长10-20分钟。

4. 本说明书所指的常温温为20-25,操作温度较低时由于溶液的扩散能力下降,各步骤需适当延长时间。

5. 基本显色液(10×)在4℃低温贮存时可能会出现沉淀,可在37℃水浴中溶解,并充分混匀后使用。

使用方法:

. 固定步骤:

1.1 漂洗:电泳结束后,凝胶中加入100 ml双蒸水中漂洗5分钟,重复漂洗1次,去除凝胶表面的电泳缓冲液。

1.2 固定:取漂洗后的凝胶放入约100 ml固定液中,在摇床上常温摇动20分钟,摇动速度为60-70 rpm。固定40分钟以上甚至过夜可以进一步降低背景。

 

固定液的配制 配制量100 ml

无水乙醇

冰醋酸

超纯水

50 ml

10 ml

40 ml

1.3 30%乙醇洗涤:

弃固定液,加入100 ml 30%乙醇,在摇床上常温摇动10分钟,摇动速度为60-70 rpm。

30%乙醇的配制

70 ml MilliQ级纯水或双蒸水中加入30 ml乙醇,混匀后即成100 ml 30%乙醇。

1.4 水漂洗:

弃30%乙醇,加入100 ml MilliQ级纯水或双蒸水,在摇床上常温摇动5分钟,摇动速度为60-70 rpm;重复漂洗一次。

. 增敏步骤:

2.1 弃水,加入100 ml增敏液(1×),在摇床上常温摇动2分钟,摇动速度为60-70 rpm。

增敏液(1×)的配制:

增敏液(100×)

超纯水

1 ml

99 ml

注:增敏液(1×)配制后需在2小时内使用。

2.2 水漂洗(2)

弃原有溶液,加入200 ml MilliQ级纯水或双蒸水,在摇床上常温摇动1分钟,摇动速度为60-70 rpm。 重复此步骤一次。

. 染色步骤:

3.1 染色:

弃水,加入100 ml染色溶液(1×),在摇床上常温摇动10分钟,摇动速度为60-70 rpm。 染色过程中,凝胶会呈微微黄色。

染色溶液(1X)的配制:

染色液(100×)

超纯水

1 ml

99 ml

注:染色溶液(1X)配制后需在2小时内使用。

3.2 水洗涤:

弃染色溶液,加入100 ml MilliQ级纯水或双蒸水,在摇床上常温摇动1-1.5分钟,摇动速度为60-70rpm。

注意:水洗涤的时间不能超过1.5分钟

. 显色步骤:

弃水,加入100 ml显色液,在摇床上常温摇动3-7分钟,直至出现比较理想的预期蛋白条带,摇动速度为60-70 rpm。

显色液的配制 配制量100 ml

基本显色液(10×)

超纯水

显色加速液(2000×)

10 ml

90 ml

50 μl

注:显色加速液(2000×)有刺激性气味,建议在通风橱内操作;

显色液配制后需在20分钟内使用。

. 终止步骤:

5.1 漂洗:弃显色液,加入100 ml双蒸水在摇床上常温摇动2分钟,漂洗掉凝胶上残留的显色液。

5.2 终止染色:

弃显色液,加入100 ml终止液(1×),在摇床上常温摇动10分钟,摇动速度为60-70 rpm。终止时有气体产生属正常现象,产生的气体为二氧化碳。

终止液(1×)的配制

终止液(20×)

超纯水

5 ml

95 ml

注:终止液(1×)配制后应当天使用。

5.3 水洗涤:

弃终止液,加入100 ml MilliQ级纯水或双蒸水,在摇床上常温摇动5分钟,摇动速度为60-70 rpm。

. 保存:

可在MilliQ级纯水或双蒸水中保存或采用适当的方式制备成干胶。

常见问题:

背景太深:

1.1. 步骤四显色时间过长。通常显色反应会在10分钟内结束,显色反应时间过长会导致背景很深。

1.2. 洗涤不充分。洗涤时间过短,或洗涤液加入的量不足,或者容器过于狭小导致摇动时溶液不易充分混合,或摇动速度过慢,导致混匀不充分。请按照说明书的建议确保各种溶液的用量和作用时间,摇床的推荐速度为60-70 rpm。

1.3 步骤1.2中凝胶中原有的缓冲液等未在固定步骤中去除干净。一方面需确保固定的时间和固定液的用量,另一方面对于不是最常用的Bis-Tris系统的凝胶需要更长的固定时间以充分去除凝胶中的原有缓冲成分,以降低背景。

1.4 水的纯度太低。需使用大于16 MΩ·cm的高纯度水。

蛋白条带非常浅:

2.1 蛋白的半胱氨酸(Cysteine)残基的含量特别低或几乎没有。半胱氨酸残基的存在对于染色非常重要,半胱氨酸残基的含量过低会导致检测灵敏度下降。

2.2 步骤3.2染色后水洗涤时间过长。在染色溶液染色时需严格控制水洗涤的时间,水洗涤的时间不能超过1.5分钟,否则会导致过多的显色离子被洗去,导致检测灵敏度下降。

2.3 上样量不足。本试剂盒检测BSA的灵敏度可以达到0.3 ng,对于不同的蛋白检测灵敏度可能不同。对于一些蛋白可能需要大于1 ng的蛋白量才能被检测到。

2.4步骤1.3和1.4的洗涤不够充分。导致少量乙酸残留,影响后续检测。确保30%乙醇洗涤和水洗涤的用量和时间,可以适当延长洗涤时间。

凝胶上出现小点或其它非蛋白的痕迹:

3.1 凝胶没有充分被溶液浸没。请注意选择大小合适的容器,并加入足量的各种溶液,同时需保持适当的混匀速度确保凝胶可以被溶液浸没。

3.2 用于染色的容器没有充分洗涤干净。容器需先用洗涤剂充分洗涤,随后用自来水充分冲洗,最后用高纯度水再洗涤数次。该容器最好能专用于染色,并注意避免各种可能的蛋白污染。

3.3 指纹或其它压痕。请注意戴手套操作,切勿直接接触皮肤。操作时请注意尽量勿挤压、

折叠或摩擦凝胶。

3.4 有金属物质接触凝胶。金属物质例如金属镊子等接触凝胶会出现非特异性痕迹。

60-70 kD处出现一片模糊的蛋白染色背景:

皮肤上脱落的角蛋白(keratin)污染了蛋白样品。一方面需注意戴手套操作,另一方面需注意盛放蛋白样品的容器盖子尽量不要敞开,甚至在取放蛋白样品时在超净台内进行以避免可能的角蛋白污染。

. 在凝胶的上半部分出现黄色背景:

5.1 样品使用了含有DTT的上样缓冲液。换用含有其它还原试剂如β-巯基乙醇的上样缓冲液。

5.2 采用Tris-Glycine-SDS电泳体系。Tris-Glycine-SDS电泳体系中的Glycine会导致

背景凝胶的顶端出现轻微的黄色背景。

实验记录表格

实验日期:

 

 

90分钟

标记√

起始时间

固定步骤

 

 

 

 

 

1.1 水漂洗

2×5 min

 

 

 

1.2 固定

20 min

 

 

 

1.3 乙醇漂洗

10 min

 

 

 

1.4水漂洗

2×5 min

 

 

增敏步骤

 

 

 

 

 

2.1 增敏

2 min

 

 

 

2.2 水漂洗

2×1 min

 

 

染色步骤

 

 

 

 

 

3.1染色

10 min

 

 

 

3.2水漂洗

1.5 min

 

 

显色步骤

 

 

 

 

 

显色

3-7 min

 

 

终止步骤

 

 

 

 

 

5.1 水漂洗

2 min

 

 

 

5.2 终止

10 min

 

 

 

5.3 水漂洗

5 min

 

 

保存

 

 

 

 

 

 


实验示例:






使用快速蛋白高灵敏度染色试剂盒 RTD6401发表部分文章列表:

1. [2022 IF=4.8] Reassortment and genomic analysis of a G9P[8]-E2 rotavirus isolated in China.

Author: Rui Peng, Dandi Li, Jindong Wang, Guangping Xiong , Mengxuan Wang, Dan Liu, Yuhang Wei, Lili Pang, Xiaoman Sun, Huiying Li, Xiangyu Kong, Saleha Shahar, Zhaojun Duan.

Product: RTD6401 快速蛋白高灵敏度染色试剂盒

Journal: Virology Journal 2023 Jun 22;20(1):135.

Institution:Universiti Teknologi Malaysia

Paper linkhttps://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37349792


 
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