植物脯氨酸检测试剂盒(茚三酮比色法)
Plant
Proline Assay Kit with Ninhydrin
● 产品组成：
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组分货号
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名称
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规格
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贮存
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PP5040-01
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试剂1-Pro裂解液
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125 ml
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RT
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PP5040-02
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试剂2-Pro标准液
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1 ml
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4℃
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PP5040-03
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试剂3-Pro显色液
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50 ml
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4℃ 避光
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● 产品简介：
脯氨酸(Proline，Pro)是一种环状的α-亚氨基酸，呈中性，等电点为6.30，易溶于水。在正常环境情况下脯氨酸含量较低，但在逆境下(旱、热、冷、冻、盐碱等)，脯氨酸常有明显积累，即积累指数与植物的抗逆性有关。植物脯氨酸检测试剂盒(茚三酮比色法)检测原理是脯氨酸与茚三酮共热发生反应，能产生稳定的红色产物，以分光光度计测定处吸光度，在一定范围内颜色深浅(即吸光度)与脯氨酸浓度成正比。
该试剂盒不使用甲苯等有害溶剂，经济环保。
该试剂盒主要用于测定植物组织中的游离脯氨酸含量，不适用于动物及医疗样品中脯氨酸的测定。
按照一次使用1 ml Pro显色液计算，试剂盒可以使用50次。
● 自备材料：
植物根茎、叶子等；剪刀；螺盖离心管或锁盖离心管或96孔板；1ml玻璃比色皿；分光光度计或酶标仪；水浴锅或干浴器；离心机
● 操作步骤：
1、 样本处理：
取新鲜植物组织，清洗干净，擦干，剪碎，迅速称取， 按照20mg重量加入1ml Pro裂解液（注意是否已经加入无水乙醇）的比例加入Pro裂解液（建议使用1.5ml螺口离心管或锁盖离心管），沸水浴或干浴处理20分钟 (期间间歇混匀)，10000 rpm离心 2分钟，上清即为脯氨酸提取液，4℃保存备用。待测提取液如不能及时测定，应置于-20℃保存，1-2天内稳定。
2、 配制系列脯氨酸标准溶液：
取1ml 试剂1-Pro裂解液全部加入到试剂2-Pro标准液的小管中，混匀后彻底溶解，即配成的Pro标准液（100mg/ml）。
取1 μl 100mg/ml 标准液加入到1ml Pro裂解液中，即配成100μg/ml Pro标准液待用。参照下表配制1-6号不同浓度的Pro标准溶液。
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编号
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1
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2
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3
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4
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5
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6
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7
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8
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100μg/ml Pro标准液加入量（ml）
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0.01
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0.02
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0.04
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0.06
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0.08
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0.10
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0.15
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0.2
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Pro裂解液（ml）
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0.49
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0.48
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0.46
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0.44
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0.42
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0.4
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0.35
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0.3
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脯氨酸含量（μg）
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1
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2
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4
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6
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8
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10
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15
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20
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4、 样品测定:
=
1 \* GB3 ① 分光光度计测定：参考下表设置反应混合液，依次加入试剂：
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编号
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0
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1-8
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9-X
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空白管
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标准管
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测定管
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试剂1-Pro裂解液
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0.5 ml
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-
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-
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步骤1中的脯氨酸提取液
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-
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-
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0.5 ml
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Pro标准液（步骤3中1-8管）
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-
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0.5 ml
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-
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试剂3-Pro显色液
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1 ml
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1 ml
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1 ml
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③ 水浴煮沸或干浴20分钟，间歇混匀。加热时务必注意避免液体暴沸溅出，可使用锁盖离心管或螺旋盖离心管。
④ 冰浴或流水冷却至室温，10000 rpm离心 2分钟，如发现没有不溶物，也可以不离心。
⑤ 取上清，用空白管作为对照，取1ml反应混合液用分光光度计测定520nm吸光度值。
=
6 \* GB3 ⑥ 酶标仪测定：参考下表设置反应混合液，依次加入试剂：
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空白管
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标准管
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测定管
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试剂1-Pro裂解液
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50 μl
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-
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-
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步骤1中的脯氨酸提取液
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-
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-
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50 μl
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Pro标准液（步骤3中1-8管）
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-
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50 μl
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-
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试剂3-Pro显色液
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100 μl
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100 μl
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100 μl
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5、 计算：
以系列脯氨酸标准(1-8号管)含量(μg)为横坐标，以对应的吸光度为纵坐标，制作标准曲线，根据测定管的吸光度进而计算其脯氨酸含量。
如使用分光光度计测定，根据如下公式计算具体样品中脯氨酸的含量：
植物组织样品脯氨酸含量(μg/g)=1.5（C×VT）/(W×VS) =3C/W
VT=步骤1中脯氨酸提取液总体积(ml)，此处为1ml
W=步骤1中使用的样品鲜重(g)
VS=步骤4中测定时加入的脯氨酸提取液体积(ml)，本实验为0.5ml
1.5系数为步骤4中反应混合液体积为1.5ml，取1ml测定吸光值
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