核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)活性的测定
核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)活性的测定
我们可以提供的试剂:
英文名称
|
中文名称
|
产地
|
规格
|
价格
|
NADH
|
还原型辅酶I
|
Roche
|
250mg
|
180元
|
RuBP
|
1,5-二磷酸核酮糖
|
Sigma
|
10mg
|
820元
|
GAPDH
|
3-磷酸甘油醛脱氢酶
|
Sigma
|
1KU
|
600元
|
PGK
|
磷酸甘油酸激酶
|
Sigma
|
1KU
|
350元
|
ADP
|
腺苷二磷酸
|
Fluka
|
100mg
|
120元
|
CrP
|
磷酸肌酸钠盐
|
Sigma
|
1g
|
100元
|
CPK
|
磷酸肌酸激酶
|
Sigma
|
1KU
|
500元
|
ATP
|
三磷酸腺苷
|
Amresco
|
5g
|
210元
|
GSH
|
还原型谷胱甘肽
|
Amresco
|
5g
|
160元
|
<原理>
核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)是光合作用碳代谢中的重要的调节酶,是植物中最丰富的蛋白质,主要存在于叶绿体的可溶部分,总量约占叶绿体可溶蛋白50%~60%。本实验用分光光度法测定酶的羧化能力。
在Rubisco的催化下,1分子的核酮糖-1,5-二磷酸(RuBP)与1分子的CO2结合,产生2分子的3-磷酸甘油酸(PGA),PGA可通过外加的3-磷酸甘油酸激酶(PGK)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的作用,产生甘油醛-3-磷酸,并使NADH氧化,反应如下:
这里1分子CO2被固定,就有2分子 NADH 被氧化。因此,由NADH氧化的量就可计算Rubisco的活性,由340nm吸光度的变化可计算NADH氧化的量。
为了使NADH的氧化与CO2的固定同步,从而需要加入磷酸肌酸(CrP)和磷酸肌酸激酶(CPK)的ATP再生系统。
(一)实验材料
菠菜叶片、小麦及水稻叶片。
(二)试剂
1、5mmol/L NADH
2、25mmol/L RuBP
3、0.2mol/L NaHCO3
4、Rubisco提取介质:40mmol/L Tris-HCl(pH 7.6)缓冲液,内含10 mmol/L MgCl2、0.25mmol/L EDTA、5mmol/L还原型谷胱甘肽。
5、反应介质:100mmol/L Tris-HCl缓冲液,内含12mmol/L MgCl2和0.4 mmol/LEDTA.Na2,pH7.8。
6、160u/mL磷酸肌酸激酶溶液。
7、160u/mL甘油醛-3-磷酸脱氢酶溶液。
8、50mmol/L ATP
9、50mmol/L磷酸肌酸。
10、160u/mL磷酸甘油酸激酶溶液。
11、菠菜的Rubisco提取液。
(三)仪器设备
紫外分光光度计,冷冻离心机,匀浆器,移液管,秒表。
<实验步骤>
1. 酶粗提液的制备
取新鲜菠菜叶片10g,洗净擦干,放匀浆器中,加入10mL预冷的提取介质,高速匀浆30s,停30s,交替进行3次;匀浆经4层纱布过滤,滤液于20000 rpm4 ℃下离心15min ,弃沉淀;上清液即酶粗提液,置0℃保存备用。
2. Rubisco活力测定
按表20-1配制酶反应体系。
将配制好的反应体系摇匀,倒入比色杯内,以蒸馏水为空白,在紫外分光光度计上340nm处反应体系的吸光度作为零点值。将0.1mL RuBP加于比色杯内,并马上计时,每隔30s测一次吸光度,共测3min 。以零点到第一分钟内吸光度下降的绝对值计算酶活力。
由于酶提取液中可能存在PGA,会使酶活力测定产生误差,因此除上述测定外,还需做一个不加RuBP的对照。对照的反应体系与上述酶反应体系完全相同,不同之处只是把酶提取液放在最后加,加后马上测定此反应体系在340nm处的吸光度,并记录前一分钟内吸光度的变化量,计算酶活力时应减去这一变化量。
<结果计算>
式中:ΔA—反应最初1min内340nm处吸光度变化的绝对值(减去对照液最初1分钟的变化量)。
N——稀释倍数。
6.22——每微摩尔NADH在340nm处的吸光系数。
2——表示每固定1mol CO2有2mol NADH被氧化。
Δt——测定时间1min。
d——比色光程,cm。