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土壤基因组DNA提取试剂盒（目录号：RTG2403）      

● 试剂盒内容及保存：

● 储存条件和效期：

本试剂盒在室温（25℃左右）干燥条件下，可保存1年。缓冲液R2和R3可能有沉淀产生，若溶液产生沉淀，应在使用前置于37℃下溶解沉淀至溶液澄清后再使用。

● 产品简介：

土壤样品存在大量的抑制因子如腐殖酸、金属离子等，而纯化的DNA 中只要有这些微量物质的存在，都会影响到PCR等酶促反应。本公司的土壤试剂盒采用独特的腐殖酸去除液（缓冲液R2）能够有效去除腐殖酸；吸附柱CG能能有效去除金属等抑制因子，提纯得到的基因组DNA可直接用于PCR 反应，酶切或定量实验。

● 准备工作：

1. 准备55℃，70℃水浴；无水乙醇；异丙醇；制冰机；1.5ml离心管；2ml离心管

2. 按照标签所示在漂洗缓冲液PW中加入无水乙醇；缓冲液R5中加入异丙醇，混匀后盖紧瓶盖后室温贮存备用。

3. 每次使用前请检查缓冲液R2，缓冲液R3是否有沉淀生成，如果出现沉淀，37℃温浴至沉淀溶解后再使用。

● 标准操作步骤：

如非指出，所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。

1. 称0.3-0.5 g土壤置于2ml离心管中，加入0.4 g Glass Beads，再加入700 μl 缓冲液R1与100 μl 缓冲液R2。涡旋器高速震荡3-5min。

注意：对含水量丰富的样品，可以预先离心除去部分水分后再称取样品。缓冲液R2是腐殖酸去除剂，100μl对大部分样品来说足以有效除去腐殖酸等抑制因子。对一些腐殖酸含量特别丰富的土壤， 缓冲液R2的量可以适当增加，但不能超过250μl，否则会严重影响DNA的得率。

2. 加入100 μl 缓冲液R3（R3如有沉淀37℃水浴完全溶解后再用），涡旋混匀。 70℃水浴处理10min。期间振荡几次。

   注意：如果要纯化革兰氏阳性菌的DNA，请在70℃处理完后，再90℃水浴处理2min。

3. 12000 rpm(~13,000g)离心1分钟，取600μl上清到1.5ml离心管中，加入180 μl 缓冲液R4混匀。

注：转移上清时确保不要吸取到沉淀，转移的上清量最好不超过80%。

4. 冰上放置5分钟。12000 rpm(~13,000g)离心1分钟。 转移上清到新的1.5ml离心管中。

注：转移上清时确保不要吸取到沉淀，转移的上清量最好不超过80%。

5. 加入与上清等体积的缓冲液R5（使用前请检查是否已加入异丙醇），颠倒混匀。

6. 取750 μl混合液加到吸附柱中（吸附柱放入收集管中），12000 rpm(~13,000g)离心30秒，倒掉滤出液。

7. 将剩余的混合液加到吸附柱中（吸附柱放入收集管中），12000rpm(~13,000g)离心30秒，倒掉滤过液。

8. 向吸附柱CG中加入500μl 漂洗缓冲液WB1，12,000 rpm (~13,000×g )  离心30 秒，倒掉废液。

9. 向吸附柱CG中加入600μl 漂洗缓冲液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000 rpm (~13,000g) 离心30 秒，倒掉废液，吸附柱CG放入收集管中。

10. 向吸附柱CG中加入600μl漂洗缓冲液PW，12,000 rpm (~13,000g) 离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CG放入收集管中。

11. 12,000 rpm(~13,000g)离心2分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

注：此步骤非常重要，其目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。

12. 将吸附柱CG转入一个干净的1.5ml离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50–100 μl经70℃水浴预热的洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟，12,000 rpm(~13,000g)离心2分钟。

注； = 1 \* GB3 ① 洗脱缓冲液体积最好不少于50 μl，体积过小影响回收效率。

= 2 \* GB3 ② 洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率。

13. DNA产物-20℃保存。

大量操作步骤（针对含微量核酸的样品）

1. 称1-5g土壤置于10ml离心管中，加入1g Glass Beads，再加入3ml 缓冲液R1与200μl 缓冲液R2。涡旋器高速震荡3-5分钟。

2. 加入600μl 缓冲液R3，涡旋混匀。70℃水浴处理10分钟。期间振荡几次。

3.3000g离心3分钟，转移上清到新的离心管中，加入550μl 缓冲液R4混匀。

4. 冰上放置5分钟。8000g离心10分钟。转移上清到新的离心管中。

5. 以下按标准操作步骤的第五步继续操作。

● DNA浓度及纯度检测：

基因组DNA片段的大小与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。提取的DNA片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。可配制0.8-1.0％琼脂糖凝胶，使用λ/HindIII判断基因组的大小，完整的基因组大小应在23kb以上。使用分光光度计检测时， OD₂₆₀/OD₂₈₀比值应为1.7–1.9之间，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水洗脱，比值可能偏低，但并不表明DNA纯度不高。

● 常见问题分析：