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AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒

AnnexinV-FITC/PI Apoptosis Detection Kit

● 产品组成：

●  产品简介：

在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V 是一种分子量为35～36kD 的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V 进行荧光素FITC 标记，以标记了的Annexin V 作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI 能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V 与PI 匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

以每次使用5 μl Annexin V-FITC计算，本试剂盒FP2050M可以检测50个样品。

●  包装组份：

●  保存条件：

4oC保存，一年有效。Annexin V-FITC和碘化丙啶染色液需要避光保存。

● 操作步骤：

一. 悬浮细胞操作流程：

1.1 诱导凋亡的操作步骤 (以Jurkat细胞为例)：

1.1.1 制备1×10⁶个/ml 的Jurkat细胞悬液。

1.1.2 加入终浓度为1 μM 的凋亡诱导剂 (STS，Staurosuporine，星孢菌素)。

1.1.3 在37℃培养箱培养3 h。

注：1 μM Staurosuporine用于诱导Jurkat cell凋亡。最佳诱导条件请根据实验的细胞类型与诱导剂调整。

1.2 Annexin V染色操作步骤：

1.2.1 将细胞悬液转移到离心管中，500 g（2500 rpm）离心3 min，去除上清液。

1.2.3沉淀中加入PBS，500 g（2500 rpm）离心 3 min，去除上清液。重复漂洗一次。

1.2.4加入Annexin V-FITC结合液，制成终浓度为1×10⁶ 个/ml的细胞悬液。

注：加入结合液的体积根据实验目的自行调整，一般推荐不少于500 μl。

1.2.5 取100 μl步骤1.2.4中制备的细胞悬液，加入到一个新的离心管中。

1.2.6 向细胞悬液中加入5 μl Annexin V-FITC，再加入5 μl 碘化丙啶染色液。

1.2.7 常温下避光放置15 min，即为待检液。

1.3 结果检测：

1.3.1 流式细胞仪检测：

步骤1.2.7中的待检液中加入400 μl Annexin V-FITC结合液。激发波长Ex = 488 nm；发射波长Em = 530 nm。Annexin V-FITC的绿色荧光通过FITC通道 (FL1) 检测；PI的红色荧光通过PI 通道 (FL2或FL3) 检测。注：荧光染料都存在淬灭的问题，建议1小时内完成检测。

1.3.2 荧光显微镜检测：

取步骤1.2.7的待检液5 μl滴于载玻片上，加5μl 抗荧光淬灭封片液，封片观察。

注：荧光染料都存在淬灭的问题，建议染色后尽快检测。

二. 悬浮细胞操作流程：

2.1 诱导凋亡的操作步骤 (以Caco-2细胞为例)：

2.1.1 制备1×10⁶个/ml 的Caco-2细胞悬液，将细胞悬液接种到培养皿或者培养板中。

2.1.2 在37℃ 5% CO₂培养箱中预培养。

2.1.3加入终浓度为25 μM的凋亡诱导剂 (Cisplatin，顺铂)。

2.1.4 在37℃5% CO₂培养箱中培养4 days。

2.2  Annexin V染色操作步骤：

2.2.1吸出细胞培养液至离心管中待用，细胞用PBS洗涤，加入适量不含EDTA的胰酶细胞消化液消化细胞。

2.2.2 常温孵育至轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，吸除胰酶细胞消化液。需避免胰酶的过度消化。

2.2.3加入步骤2.2.1中收集的细胞培养液，稍混匀，转移到离心管内，2000 rpm 5 min，小心吸除上清。

注意：加入的细胞培养液一方面可以收集已经悬浮的发生凋亡或坏死的细胞，另一方面细胞培养液中的血清可以有效抑制或中和残留的胰酶；残留的胰酶会消化并降解后续加入的Annexin V-FITC导致染色失败。

2.2.4 细胞沉淀中加入预冷PBS轻轻重悬细胞，2000 rpm 5 min，小心吸除上清；重复洗涤一次。

2.2.5细胞沉淀中加入适量Annexin V-FITC结合液，制成终浓度为1×10⁶ 个/ml的细胞悬液。

注：加入结合液的体积根据实验目的自行调整，一般推荐不少于500 μl。

2.2.6 取100 μl步骤2.2.5中制备的细胞悬液，加入到一个新的离心管中。

2.2.7 向细胞悬液中加入5 μl Annexin V-FITC，再加入5 μl 碘化丙啶染色液。

2.2.8 常温下避光放置15 min，即为待检液。

2.3 结果检测：

2.3.1 流式细胞仪检测：

步骤2.2.8中的待检液中加入400 μl Annexin V-FITC结合液。激发波长Ex = 488 nm；发射波长Em = 530 nm。Annexin V-FITC的绿色荧光通过FITC通道 (FL1) 检测；PI的红色荧光通过PI 通道 (FL2或FL3) 检测。注：荧光染料都存在淬灭的问题，建议1小时内完成检测。

2.3.2 荧光显微镜检测：

取步骤2.2.8的待检液5 μl滴于载玻片上，加5μl 抗荧光淬灭封片液，封片观察。

检测程序：

Jurkat细胞调整到1×10⁶/ml，6孔板接种2 ml；凋亡处理加10 μl 0.2 M STS（星型饱菌素），终浓度为1 μM；37度 5%二氧化碳培养3小时；2 ml收集，PBS漂洗2次，重悬于300 μl 结合液中；调整细胞密度为1×10⁶/ml制成细胞悬液。取100 μl细胞悬液加5 μl Annexin V-FITC，5 μl 碘化丙啶染色液，RT 避光静置15min，取5 μl加5 μl封片液，封片观察。FITC（+）PI（+）为凋亡晚期细胞（40×）。

● 注意事项：

1. 本试剂盒适用于检测活细胞，流式细胞仪检测时，细胞数量不应低于1×10⁶，不推荐用于检测组织样本。

2. 推荐使用悬浮培养细胞。如果是贴壁细胞，需用不含 EDTA 的胰酶消化，如消化不当，可能引起假阳性，而用细胞刮子会造成细胞粘连成团，而影响检测。

3. 细胞固定后可能导致荧光的淬灭，请不要固定样品。

4. 消化贴壁细胞残留的胰酶会消化并降解Annexin V-FITC，最终导致染色失败。

5 .因检测细胞的类型、凋亡诱导剂种类、使用的检测仪器不同，因而流式检测的荧光补偿也不同，因此建议每次检测均需使用未经凋亡诱导处理的细胞作为对照，进行荧光补偿的调节。