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RealPure^®Plant Seed RNA Extraction Kit

RealPure^®植物种子RNA提取试剂盒

● 试剂盒内容及保存：

● 储存条件和效期：

RNase-free水4℃保存；其他试剂在常温（25℃左右）干燥条件下，可保存1年。试剂盒常温运输。

● 产品简介：

本试剂盒可从植物种子中快速提取总RNA，通过独特的裂解系统，快速去除植物组织中的淀粉、多糖等成分，释放 RNA。试剂盒配套缓冲液PRS（Phenolic Remove Solution）可以去除种子中的多糖多酚对RNA提取的影响。另外，试剂盒配套DNA清除柱，可以消除基因组DNA的污染。整个提取过程仅需20-30分钟内即可完成，可以从50 mg植物种子中提取数十微克高纯度RNA，基本没有DNA和蛋白的污染，可用于Northern blot、Dot blot、polyA 筛选、体外翻译、RNase 保护分析和分子克隆等实验。

已经测试的植物种子有：拟南芥干种子、小麦干种子、水稻干种子、芝麻种子、玉米干种子、豌豆种子、红豆干种子、绿豆干种子、向日葵种子、西瓜种子、油莎豆、花生、大豆等。另外，该试剂盒也适合于提取块茎、鳞茎的RNA。

● 准备工作：

1操作前在裂解液RSL中加入β-巯基乙醇至终浓度5%，如500 μl RSL中加入25 μl β-巯基乙醇。此裂解液最好现用现配。配好的 RSL4 ℃可放置3天。

2 按照标签所示在漂洗液RW中加入无水乙醇（自备），混匀后盖紧瓶盖后常温贮存备用。

3 准备65℃水浴

4 所有离心步骤均在常温下进行。

● 操作步骤：

1. 样品处理:

1.1 1.5 ml RNase-free离心管中加入500 μl裂解液RSL（使用前请先检查是否已加入β-巯基乙醇），50 μl缓冲液PRS混匀备用。

   注：缓冲液PRS有助于去除样品中的多糖和多酚，禾本科植物如水稻，小麦和玉米的种子RNA提取中可以不用添加；如不能判断材料是否含多糖和多酚，请加入缓冲液PRS。

1.2将种子加入到液氮预冷的研钵中，用研杵研磨，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状。取20-50 mg粉末迅速加入到离心管中，涡旋剧烈震荡混匀，65℃水浴放置5分钟，间歇混匀。

注：一定不要加入超过50 mg的粉末，否则样品超过裂解液RSL的裂解能力导致RNA提取失败。

2. 离心取上清：

13,000 rpm离心5 min，小心吸取收集管中的上清至1.5 ml RNase-free的离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀。一般可获得400 μl上清。

注：一些种子富含油脂如花生种子，离心后脂肪位于最上层，用吸头穿越脂肪层吸取上清；禾本科植物如水稻，小麦，玉米，高粱种子会有大量沉淀生产。

3. 去除基因组污染：

上清中加0.5倍体积的无水乙醇（如400 μl上清中加入200 μl无水乙醇），混匀（此时可能会出现沉淀），得到的溶液和沉淀一起转入DNA清除柱CS（清除柱放入收集管中）中，13,000 rpm离心2分钟，弃掉收集管中的废液。

注：吸附柱的最大容积是850 μl，超过此体积分步上柱，确保全部溶液都通过过滤柱，如果膜上有残留液体，延长离心时间至5分钟，保证膜上无残留液体。

4. 洗脱RNA：

  将DNA清除柱放入2 m l RNase-free离心管中，在清除柱中加入500 μl 裂解液RL plus，13,000 rpm离心1分钟，收集滤液（注意：RNA在滤液中，不要丢弃），滤液中加入250 μl无水乙醇，此时可能会出现沉淀，立即混匀，不要离心。

5. RNA挂柱：

  将全部溶液加入到RNA吸附柱CR中（吸附柱放入收集管中），13,000 rpm离心2分钟，弃废液。

注：确保溶液全部过滤到收集管中，膜上无残留，如有必要，可以延长离心时间至5分钟。

6. 去除RNA中的蛋白污染：

向RNA吸附柱CR中（吸附柱放入收集管中）加入500 μl 去蛋白液RD，13,000 rpm离心1分钟，弃废液。

7. 去除RNA中的其他杂质：

向RNA吸附柱CR中加入700 μl漂洗液RW（使用前请先检查是否已加入乙醇）， 13,000 rpm离心1分钟，弃废液。

8. 进一步去除RNA中的其他杂质：

向吸附柱CR中加入500 μl漂洗液RW （使用前请先检查是否已加入乙醇），13,000 rpm离心1

分钟，弃废液。

9.  关键步骤：彻底去除吸附柱上的残余乙醇：

将吸附柱CR放回收集管中，确保盖好吸附柱管盖，13,000 rpm将吸附柱CR空甩离心2 分钟，去除吸附柱上的残余液体。

注：此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，如果有漂洗液残留，可能会影响后续的RT等实验操作。

10. 洗脱得到RNA：

将RNA吸附柱CR转入一个新的1.5 ml RNase-free离心管中，向吸附柱O型垫圈中央悬空加入50-100 μl RNase-free水（事先65℃预热可提高洗脱效率），盖好吸附柱管盖，常温放置2分钟，13,000 rpm离心2 分钟。

注：确保水要加到膜的中央，不要贴壁加入；洗脱缓冲液体积不应少于50 μl，体积过小影响回收效率。

11. RNA贮存：

RNA样品-80℃中保存。

● RNA产量和质量的评估：

1. RNA产量：

用分光光度计测定OD₂₆₀的吸光值来计算RNA产量。将RNA按照一定的比例稀释于TE溶液（10mMTris pH8.0，1mMEDTA）中，根据以下公式计算：

A₂₆₀×稀释倍数×40=μg RNA/ml

注：测定OD值时，尽量不要用RNase-free水稀释RNA，因为RNase-free水pH较低，测定的OD值偏低。

2. RNA质量：

凝胶电泳检测：凝胶电泳中，完整的RNA应该有两条主带：28S和18S，并且28S亮度应该与18S相当或是其亮度的2倍。可以使用普通的1×TAE琼脂糖凝胶电泳，凝胶浓度1.5 %，可以使用高电压，短时间电泳，如7V/cm电泳，20分钟。建议使用D2000 DNA ladder（Cat：RTM415）作为Marker。植物28S rRNA迁移率与1500 bp类似，18S rRNA迁移率与1000bp类似。

吸光值检测：可以用A₂₃₀，A₂₆₀和A₂₈₀的数值表示RNA的纯度。纯净的RNA的 A₂₆₀/A₂₈₀比值应该为2，我们得到的RNA样品比值应在1.8-2.2之间，如果比值低于1.8，表明RNA样品中蛋白污染比较严重。

A₂₆₀/A₂₃₀比值应该在2-2.2之间。如果此比值低于2，表明RNA样品中有胍盐，多糖的污染。

实验示例：