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RealPure Plant RNA Extraction Kit

（for containing high polysaccharide and polyphenol components）

RealPure多糖多酚植物RNA提取试剂盒

● 试剂盒内容及保存：

● 储存条件和效期：

RNase-free水4℃保存；其他试剂在常温（25℃左右）干燥条件下，可保存1年。试剂盒常温运输。

● 产品简介：

本试剂盒可从植物叶片、茎、幼苗、果肉中快速提取总RNA，可同时处理大量不同样品。试剂盒配套缓冲液PRS（Phenolic Remove Solution）可以去除植物中的多糖多酚对RNA提取的影响。20-30分钟内即可完成反应，提取的总RNA纯度高，没有DNA和蛋白的污染，可用于Northern blot、Dot blot、polyA 筛选、体外翻译、RNase 保护分析和分子克隆等实验。

该试剂盒不能有效提取植物种子、块茎、鳞茎的RNA，提取这些材料的RNA请选择RealPure植物种子RNA提取试剂盒（Cat：RTR2308）。

● 准备工作：

1操作前在裂解液RL中加入β-巯基乙醇至终浓度1%，如500 μl RL中加入5 μl β-巯基乙醇。此裂解液最好现用现配。配好的 RL4 ℃可放置3天。

2 按照标签所示在漂洗液RW中加入无水乙醇（自备），混匀后盖紧瓶盖后室温贮存备用。

3 所有离心步骤均在常温下进行。

● 操作步骤：

1. 样品处理:

1.1 1.5 ml离心管中加入500 μl裂解液RL（使用前请先检查是否已加入β-巯基乙醇），50 μl缓冲液PRS混匀备用。

注：多糖多酚植物（如银杏，毛白杨等）加入RL后，要加入缓冲液PRS，普通植物（如拟南芥，小麦，水稻，烟草）可以不加缓冲液PRS。如果不能判断植物是否为多糖多酚植物，请加入缓冲液PRS。

注：快速判断是否为多糖多酚植物：

取20mg左右的植物材料，放入1.5 ml离心管中，加入0.5 ml 0.2 M NaOH溶液，95℃ 10分钟，观察裂解物颜色。颜色为绿色或淡黄色为普通植物；颜色为棕黄色或棕红色为多糖多酚植物。

1.2将植物材料加入到液氮预冷的研钵中，用研杵研磨，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状。取50 mg粉末迅速加入到离心管中，涡旋剧烈震荡混匀，常温放置5分钟。

注：一定不要加入超过50 mg的粉末，否则样品超过裂解液RL的裂解能力会导致RNA提取失败。

2. 离心取上清：

13,000 rpm离心5 min，小心吸取收集管中的上清至1.5 ml RNase-free的离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀。一般可获得400 μl上清。

3. 去除基因组污染：

上清中加入0.5倍体积的无水乙醇（如400 μl上清中加入200 μl无水乙醇），混匀（此时可能会出现沉淀），得到的溶液和沉淀一起转入DNA清除柱CS（清除柱放入收集管中）中，13,000 rpm离心2分钟，弃掉收集管中的废液。

注：确保全部溶液都收集到收集管中，如果膜上有残留液体，延长离心时间至5分钟，保证膜上无残留液体。

4. 洗脱RNA：

  将DNA清除柱放入一干净的2 ml离心管中，在清除柱中加入500 μl 裂解液RL plus，13,000 rpm离心1分钟，收集滤液（注意：RNA在滤液中，不要丢弃），滤液中加入250 μl无水乙醇，此时可能会出现沉淀，立即混匀，不要离心。

5. RNA挂柱：

  将全部溶液加入到RNA吸附柱CR中（吸附柱放入收集管中），13,000 rpm离心2分钟。

注：确保溶液全部过滤到收集管中，膜上无残留，如有必要，可以延长离心时间至5分钟。

6. 去除RNA中的蛋白污染：

向RNA吸附柱CR中（吸附柱放入收集管中）加入500 μl 去蛋白液RD，13,000 rpm离心1分钟，弃废液。

7. 去除RNA中的其他杂质：

向RNA吸附柱CR中加入700 μl漂洗液RW（使用前请先检查是否已加入乙醇）， 13,000 rpm离心1分钟，弃废液。

8. 进一步去除RNA中的其他杂质：

向吸附柱CR中加入500 μl漂洗液RW （使用前请先检查是否已加入乙醇），13,000 rpm离心1

分钟，弃废液，将吸附柱CR放回收集管中，确保盖好吸附柱管盖。

9.  关键步骤：彻底去除吸附柱上的残余乙醇：

13,000 rpm将吸附柱CR空甩离心2 分钟，去除吸附柱上的残余液体。

注：此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，如果有漂洗液残留，可能会影响后续的RT等实验操作。

10. 洗脱得到RNA：

将RNA吸附柱CR转入一个新的1.5 ml RNase-free离心管中，向吸附柱O型垫圈中央悬空加入50-100 μl RNase-free水（事先65℃预热可提高洗脱效率），盖好吸附柱管盖，常温放置2分钟，13,000 rpm离心2 分钟。

注：确保水要加到膜的中央，不要贴壁加入；洗脱缓冲液体积不应少于50 μl，体积过小影响回收效率。

11. RNA贮存：

RNA样品-80℃中保存。

● RNA产量和质量的评估：

1. RNA产量：

用分光光度计测定OD₂₆₀的吸光值来计算RNA产量。将RNA按照一定的比例稀释于TE溶液（10mMTris pH8.0，1mMEDTA）中，根据以下公式计算：

A₂₆₀×稀释倍数×40=μg RNA/ml

注：测定OD值时，尽量不要用RNase-free水稀释RNA，因为RNase-free水pH较低，测定的OD值偏低。

2. RNA质量：

凝胶电泳检测：凝胶电泳中，完整的RNA应该有两条主带：28S和18S，并且28S亮度应该与18S相当或是其亮度的2倍。可以使用普通的1×TAE琼脂糖凝胶电泳，凝胶浓度1-1.5 %，可以使用高电压，短时间电泳，如7V/cm电泳，20分钟。建议使用D2000 DNA ladder（Cat：RTM415）作为Marker。植物28S rRNA迁移率与1500bp类似，18S rRNA迁移率与1000bp类似。