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His标签蛋白纯化试剂盒

● 产品简介：

His标签蛋白纯化试剂盒（His-tag Protein Purification Kit）也称为镍柱试剂盒，采用NTA His-tag 纯化树脂可以兼容高浓度变性剂(8M尿素或6M盐酸胍)，能够简单、快速、灵活、高效并且高特异性地在非变性或变性条件下纯化His标签蛋白。纯化原理：通常带有6个组氨酸标签的重组蛋白(6X His-tagged recombinant protein)或带有6个以上连续组氨酸标签的重组蛋白，被称为His标签蛋白。蛋白样品溶液通过NTA His-tag 纯化树脂时，重组蛋白His标签上的组氨酸残基能特异性地结合到树脂中的镍离子上，其它蛋白则不能被结合。洗涤后，His标签重组蛋白被洗脱，从而被分离纯化。

试剂盒配套的NTA His-tag 纯化树脂采用高度交联的6%琼脂糖凝胶(Sepharose CL-6B)为基质，并使用了进一步优化的连接臂和镍离子螯合技术，非特异性蛋白结合显著降低，耐受压力强，镍离子螯合非常稳定。具体参数如下：

本试剂盒用途广泛，可以用于在非变性条件和变性条件下纯化His标签蛋白。试剂盒配套有蛋白纯化柱，只需通过离心即可完成His标签蛋白的结合、漂洗及洗脱步骤，方便快捷。

按照每次收集2 ml细菌沉淀，每次使用50 μl NTA His-tag树脂纯化，参考本说明书本试剂盒足够进行20次的小量His 标签蛋白纯化。每次蛋白(~55kD)的最大纯化量为0.5-1 mg。

● 贮存及运输：

4-8℃保存，至少一年有效;试剂盒常温运输。

● 产品组成：

● 使用说明：

一. 大肠杆菌中His标签重组蛋白的诱导表达：

1.1 挑取含His标签重组蛋白的单克隆，接种到10 ml相应抗生素的LB培养液中，培养过夜。

1.2 按照1:20的比例取培养过夜的菌液，接种到含相应抗生素的LB培养液中。例如取1ml培养过夜的菌液接种到20ml含适当抗生素的LB培养液中。

1.3 37℃常规培养约30-60 min或更长时间，至菌液的OD₆₀₀达到0.6。

   注:OD值非常重要，0.6为细菌生长的对数期。

1.4 加入IPTG至终浓度为0.4-1 mM，适当温度继续培养4-5小时。

注：加入IPTG前留取1 ml菌液作为未诱导的对照。对于特定蛋白的诱导表达，最佳的IPTG浓度、诱导温度、和诱导时间需要通过实验确定。

1.5 取2 ml菌液加入到2 ml离心管中，4℃ 13,000 g离心1min，弃上清，收集菌液沉淀。随后即可进入细菌裂解步骤。

注：菌液沉淀也可以在-80oC冻存备用。冷冻保存的菌体使用前需置于冰上解冻15 min。

二. His标签蛋白的小量纯化：

2.1 裂解：

接步骤1.5，细菌沉淀中加入100 μl 非变性裂解液/变性裂解液，将细菌沉淀充分重悬于裂解液中，可进行轻微的漩涡混匀(尽量避免产生气泡)。

a 裂解液的使用量：

根据His标签重组蛋白表达的丰度，菌液和裂解液的体积比可以在25:1-5:1范围内适当调整。表达丰度非常高时，每毫升菌液沉淀可以加入200 μl裂解液；表达丰度非常低时，每毫升菌液沉淀可以加入40 μl裂解液。

b 非变性裂解液和变性裂解液的选择：

多数情况下应优先选择非变性条件进行目的蛋白的裂解，因为此条件下得到的纯化蛋白是有活性的。如果发现非变性条件目的蛋白的裂解效果欠佳，但目的蛋白的表达量能达到预期时，首先宜考虑调整目的蛋白的诱导表达条件，例如调整IPTG等诱导剂的浓度和诱导时的温度等。如果调整诱导条件后在非变性条件下仍然裂解效果欠佳，此时再考虑选择变性条件进行裂解、洗涤和洗脱。变性条件下使用尿素作为变性剂，样品溶解性好，洗脱样品无需透析可以直接PAGE检测，最终纯化获得的目的蛋白可以通过透析去除尿素后复性得到有活性的蛋白。

2.2 可选步骤：

加入终浓度1 mM PMSF或蛋白酶抑制剂混合物，混匀。

    注:蛋白酶抑制剂能防止蛋白降解。

2.3 酶解：

加入终浓度1 mg/ml溶菌酶并轻轻混匀，尽量避免产生气泡，冰水浴或冰上放置30min。

注：溶菌酶根据标签指示用灭菌水配制成100 mg/ml的母液，现用现加。溶菌酶配制成母液后，可以适当分装后-20℃保存。

2.4超声：

冰上超声裂解细菌。超声功率200-300 W，每次超声处理10 s，每次间隔10 s，共超声处理6-10次。具体超声处理的方式须根据特定型号的超声仪器自行摸索和优化。

注：此步骤非常重要，如果超声不彻底，His标签蛋白不能有效释放，会导致大量目的蛋白在步骤2.5离心后会留在沉淀中，导致蛋白纯化效率大大降低。

2.5 离心得到上清：

4℃ 13000 rpm 离心10 min，收集上清至1.5ml离心管中，取10 μl上清留样作后续检测用。待纯化的His标签蛋白即在上清中。

2.6 蛋白纯化柱装配：

2.6.1 蛋白纯化空柱（纯化空柱放入2 ml收集管中）中加入50 μl NTA His-tag树脂，旋紧盖子，拧掉柱子底部的连接。4℃ 2000 rpm 1分钟，弃收集管内溶液。

注：转速不要高于2000 rm，高转速容易损伤树脂。

2.6.2 纯化柱中加入500 μl非变性裂解液/变性裂解液，旋紧盖子，4℃ 2000 rpm 1分钟，弃收集管内溶液；

2.6.3 重复2.6.2步骤一次。

注：此两个步骤是用缓冲液平衡树脂，可以有效提高蛋白纯化效率。

2.7 树脂螯合His标签蛋白：

2.7.1将红色堵头安装在纯化柱下端突起上，纯化柱中加入步骤2.5得到的上清（约80-90 μl），旋紧盖子。4℃ 摇床摇动30分钟，使蛋白和树脂充分结合。

注：树脂和蛋白结合可以混合更长时间，可以过夜处理。

2.7.2 拔掉红色堵头，将纯化柱放入2 ml收集管中，旋紧盖子，4℃ 2000 rpm 1分钟。

注：建议保留流穿液待检，检测树脂的结合能力。

2.8 漂洗：

2.8.1 纯化柱内加入500 μl 非变性漂洗液/变性漂洗液，4℃ 2000 rpm 1分钟，弃收集管内溶液。

2.8.2 重复2.8.1步骤再次漂洗一次。

2.9 洗脱：

2.9.1 将纯化柱转移到一干净1.5 ml离心管中，加入30-50 μl非变性洗脱液，轻弹混匀，4℃ 2000 rpm 1分钟，1.5ml离心管内即为纯化的目的蛋白；

2.9.2重复2.9.1再次洗脱一次。

2.10 收集：

收集两次洗脱液即为纯化的目的蛋白，-20℃或-80℃贮存。

● 实验示例：

非变性条件下His-tag蛋白纯化

电泳条件：1×TGS，4-20% RealPAGE Precast Gel 150V 60min

M1：RTD6105 双色预染宽分子量蛋白Marker（10-170 kD）

M2：RTD6111 宽分子量蛋白Marker（10-200 kD）

未诱导对照（步骤1.4）；IPTG诱导对照（步骤1.6 ）；

               离心后上清（步骤3.5 ）；流穿液FT（步骤3.7.2）； 

               漂洗液1 （W1）（步骤3.8.1 ）；漂洗液2 （W2）（步骤3.8.2 ）；

               洗脱液1（E1）（步骤3.9.1）； 洗脱液2（E2）（步骤3.9.2）