TBE-PAGE电泳可以选择RTM441 20bp DNA ladder作为分子量标准。
DNA非变性PAGE电泳试剂盒（货号RTE4101）
DNA Native PAGE
Electrophoresis Kit
● 产品组成：
|
货号
|
名称
|
规格
|
保存条件
|
|
AC2913-01
|
30%PAA(29:1)
|
100 ml
|
4℃
|
|
TB001
|
5×TBE
|
500 ml
|
RT
|
|
AP020P
|
APS（干粉）
|
5 ml
|
RT（配制后-20℃贮存）
|
|
TA0761-01
|
TEMED
|
0.5 ml
|
4℃，避光
|
|
DL070
|
6×Native-PAGE DNA上样缓冲液
|
1 ml
|
4℃
|
● 产品简介：
非变性 PAGE 电泳是研究DNA构象变化的常用手段，在非变性条件下DNA的泳动与电荷、片段大小、DNA结合的蛋白及折叠构象都有关系。非变性PAGE电泳是研究单链 PCR片段构象多态性（SSCP-PCR，single-strand conformation polymorphism-PCR）的重要研究手段。在SSCP测定中，双链DNA（dsDNA）变性为单链DNA（ssDNA），每一条单链DNA都基于他们的内部序列呈现不同的折叠构象，即使相同长度的单链DNA因其碱基顺序不同，甚至单个碱基的不同都会形成不同的构象。这些不同构象的ssDNA 在非变性PAGE中得到分离。另外，非变性PAGE还可以分离小片段的双链DNA，与琼脂糖电泳相比，对低于500bp的双链DNA片段有更优秀的分辨率。
本公司提供的DNA非变性PAGE电泳试剂盒包含凝胶制备及电泳所需的全部试剂，用户只需自备制胶器具和蒸馏水，即可配制各种浓度的PAGE胶，使用方便。
本试剂盒大约可以配制20-45块常规大小（8×10cm）PAGE凝胶，具体数量根据凝胶厚度决定：0.75mm厚度凝胶可以配制45块胶，1mm厚度凝胶可以配制至少35块胶，1.5mm厚度凝胶可以配制至少20块胶。
● 贮存和效期：
本产品常温运输，按照标签温度贮存；有效期一年。
● 使用说明：
10% APS配制-5 ml：
将0.5 gAPS干粉溶于5 ml灭菌水中，彻底溶解后分装，1 ml/支，-20℃备存，每次取一管使用。10% APS应尽量减少室温存放时间，以防失效。10%APS在4℃有效期为一周，-20℃有效期6个月。若发现凝胶聚合时间延长，应考虑更换使用-20度保存的10% APS。
一、制备凝胶步骤：（以下步骤为制备8×10cm厚度1.0mm胶）
1.1 参照凝胶模具说明书，装配好凝胶模具。
1.2按照表一将不同体积的成分在小烧杯或试管中混合；最后加入10%APS和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。
1.3在凝胶模具中灌入适量分离胶溶液（对于mini-gel，凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5 cm或距梳齿约0.5 cm即可），然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1-5
cm的水层，使凝胶表面保持平整。
1.4静置10-20分钟，待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面后，说明凝胶已聚合
表一 TBE-PAGE分离胶配方表 (总体积5 ml，适用于厚度1.0 mm小板胶)
|
|
|
各组份体积（ml）
|
|
最佳DNA分离范围
|
凝胶浓度
|
灭菌水
|
30%PAA（29：1）
|
5×TBE
|
10%APS
|
TEMED
|
|
70-450 bp
|
6%
|
3
|
1.0
|
1.0
|
0.05
|
0.005
|
|
60-460 bp
|
8%
|
2.66
|
1.34
|
1.0
|
0.05
|
0.005
|
|
50-300 bp
|
10%
|
2.33
|
1.67
|
1.0
|
0.05
|
0.005
|
|
40-200 bp
|
12%
|
2
|
2.0
|
1.0
|
0.05
|
0.005
|
|
25-150 bp
|
15%
|
1.5
|
2.5
|
1.0
|
0.05
|
0.005
|
|
5-100 bp
|
20%
|
0.66
|
3.34
|
1.0
|
0.05
|
0.005
|
注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。
1.5去除覆盖在分离胶上的水层；按照表二将不同体积成分在一个小烧杯或试管中混合；最后加入10%过硫酸铵和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。
表二 TBE-PAGE 4%浓缩配方表 (总体积1.5 ml，适用于1.0mm厚度胶)
|
|
各组份体积（ml）
|
|
凝胶浓度
|
灭菌水
|
30%PAA（29：1）
|
5×TBE
|
10%APS
|
TEMED
|
|
4%
|
1.0
|
0.2
|
0.3
|
0.02
|
0.002
|
1.6将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端；将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。
1.7静置30-60分钟，等待浓缩胶聚合。
注：凝胶的聚合时间与环境温度有关。夏天温度较高时，聚合较快；冬天气温低时，聚合时间会延长。可以根据环境温度的不同调节APS的加入量。
二、电泳：
2.1 1×TBE电泳液配制：取100ml 5×TBE，加蒸馏水400 ml，即配成500
ml 1×TBE。将凝胶板固定在电泳装置上，往上槽和下槽中加入足够1×TBE电泳液。 用1ml吸头冲洗加样孔1-2次。
2.2 取待测样品，加入相应体积6×Native PAGE DNA上样液，如5 μl样品加1 μl 上样液，短暂离
心后取5-10 μl上样。TBE-PAGE中判断双链DNA大小可以选择20bp
DNA ladder（货号：RTM441）作为DNA Marker。
2.3 连接电源线，打开电源开关。200 V稳压电泳。至二甲苯菁指示前沿到达凝胶三分之二位置时结束电泳。
|
TBE-PAGE电泳
|
|
恒电压
|
起始电流
|
结束电流
|
电泳时间
|
|
200
V
|
20-25 mA/板胶
|
10-15
mA/板胶
|
70+min
|
三、染色：
3.1 漂洗：玻璃板上拆下凝胶后，适量蒸馏水漂洗3-5分钟。
3.2 染色液配制：
TBE-PAGE胶可以使用EB或RealSafe类染料后染染色，以下程序用RealSafe Red核酸染料进行染色。即用型染色液配制：
|
|
即用型RealSafe核酸染色液
|
|
|
100 ml
|
|
1×TBE
|
100 ml
|
|
RealSafe Red核酸染料
|
20 μl
|
3.3染色：
凝胶浸泡于即用型染色液中，常温避光摇床40-60rpm染色30 分钟。
五、常见问题：
1. 为何 SSCP-PCR带型有复合条带？
原因之一：可能是残留的 PCR 引物跟单链的 DNA 结合形成迁移率不同的条带。解决方法是稀释PCR或电泳前将PCR产物进行纯化。
原因之二：可能是PCR产物用量过高，彼此复性。解决办法是将PCR产物稀释后4-8倍后使用。
2. 如何提高电泳分辨率？
可以在配胶时加入甘油（终浓度为5%-10%），因为甘油是弱变性剂，能部分展开 DNA 折叠结构，增加表面积，增加电泳时位移差异。但加入甘油后粘性变大，电泳速度变慢，因此只适合常温电泳使用，不要4℃电泳。如果条件允许，最好同时做加甘油和不加甘油的电泳实验。
实验示例
点击查看
详细信息
内勤订货QQ：2446698252 技术支持QQ：460449375
电子邮箱：real-times@vip.163.com
