本产品采用高保真的pfu酶，通过反向PCR法（Inverse
PCR）进行定点突变。以环状DNA（如质粒）为模板，以反方向设计的两条引物对质粒进行完整的PCR，pfu
DNA聚合酶合成突变链；随后使用GM酶消化PCR产物，降解非突变型质粒模板（甲基化质粒模板），随后进行转化感受态细胞，有效地筛选出突变克隆（图一）。
本产品特征：
1. 采用部分重叠引物设计(图二)，使PCR呈指数扩增，扩增产物凝胶电泳可见；扩增产物为环状，易于转化。
2.
突变的真实性：可以得到高达95％的突变体。而且，由于采用pfu 高保真聚合酶，PCR过程中的第二位点突变（目标突变以外的突变）的可能性极小。四、使用说明
1.
引物设计(图二)：
(1) 共需设计两条部分序列重叠的引物。引物包含5' 端重叠区和3'
端延伸区。
(2) 引物长度：两条引物的长度大约30-45个核苷酸，5'
端重叠区包含15-20个碱基，3'
端延伸区包含至少10个碱基。
(3) 突变引物：突变点位于两条引物上；正向引物的突变点位于重叠区下游，紧邻重叠区；反向引物的突变点位于5'
端。
(4) 引物GC含量：在可能的情况下，尽量把引物的GC含量控制在40％-60％。
(5) 在可能的情况下，尽量使引物不要产生非常稳定的二级结构和引物二聚体。二级结构和二聚体可以通过一些软件进行分析，如Oligo。
(6) 最好使用经过PAGE纯化的引物或更高纯度的引物。
2.
待突变模板质粒的选择：
必需使用从dam＋的大肠杆菌(这类菌中质粒可以被甲基化)中抽提得到的质粒用于基因定点突变，如DH5α、JM109等。
选择GC含量在40-55％的待突变模板质粒，并且每一个50bp左右的局部GC含量最好也不超过70%。如果GC含量过高，请先把目的基因克隆到其它合适的载体上，再进行基因定点突变反应。另外目的基因GC含量最好也在40-55％的范围，并且每一个50bp左右的局部GC含量最好也不超过70%。如果目的基因GC含量过高，而突变位点不在高GC含量区域，可以先把该基因的不含高GC含量的一个区域克隆出来，进行定点突变，然后再把突变后的片断克隆回原基因中。如果必需使用高GC含量的质粒模板，或者有局部高GC含量的质粒模板，请另外使用专门用于高GC含量模板的PCR反应试剂。
3.
对照质粒：
本试剂盒中含有对照质粒（pTGWB），其LacZ基因已经突变，第6个氨基酸密码子突变为TAA（终止密码子）（图三）。当被转化入大肠杆菌后，在X-Gal板上形成白色菌落。利用试剂盒添附的对照引物进行突变反应后，该密码子可从TAA（终止密码子）恢复为CCA（Pro），转化后可在X-Gal板上产生蓝色菌落，这样就可以简单地确认突变反应是否正确进行。根据本实验操作步骤进行该突变反应，通常可获得80％以上的蓝色菌落。
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